Lek. med. Tomasz MŁYŃCZAK

Katedra i Klinia Okulistyki UM we Wrocławiu

Mikroskopia konfokalna – nowe narzędzie w diagnostyce schorzeń rogówki

Zastosowanie mikroskopii konfokalnej pozwala w sposób bezinwazyjny uzyskać

w czasie rzeczywistym optyczne przekroje tkanki rogówki na poziomie komórkowym.

Do niedawna powszechnie stosowane metody obrazowania powierzchni oka wykorzystywały tradycyjną biomikroskopię (lampy szczelinowe). Dynamiczny rozwój technologiczny ostatnich 2–3 dekad przyczynił się do wprowadzenia do codziennej praktyki klinicznej kolejnych narzędzi obrazujących rogówkę i przedni odcinek oka, takich jak ultradźwiękowa biomikroskopia (UBM) i optyczna koherentna tomografia (OCT). Narzędzia te, jakkolwiek przydatne w ocenie makroskopowej struktur oka, nie dostarczają żadnych danych dotyczących mikroskopowej morfologii badanej tkanki. Te ostatnie uzyskiwano dzięki badaniom histologicznym ex vivo, których użyteczność jest jednak ograniczona przez degenerację tkanki wraz z rozwijającym się procesem chorobowym, rozmaite artefakty i brak możliwości oceny zmian tkanki w czasie. Nowym źródłem informacji w diagnostyce schorzeń rogówki stała się rozwijana dopiero na przełomie lat osiemdziesiątych i dziewięćdziesiątych mikroskopia konfokalna, która jest badaniem umożliwiającym otrzymanie optycznych przekrojów rogówki o grubości kilku µm, pozwalających przyżyciowo i nieinwazyjnie oceniać poszczególne jej warstwy.

Ryc. 1. Schemat zasady działania mikroskopu konfokalnego.

Zasada działania mikroskopu konfokalnego

Zasadnicze ograniczenie konwencjonalnej mikroskopii świetlnej polega na tym, że promienie świetlne odbijane przez struktury otaczające obserwowany punkt pogarszają jakość obrazu, ściemniając go i powodując aberracje chromatyczne. Dlatego właśnie w używanych powszechnie przez okulistów lampach szczelinowych dostępne powiększenia nie są większe niż 40-krotne, a ich rozdzielczość nie przekracza 20 µm.

Mikroskop konfokalny, skonstruowany w 1957 roku przez amerykańskiego naukowca Marvina Lee Minsky’ego, pierwotnie używany był do badań in vitro nad tkanką nerwową.

Ryc. 2. Komórki pośrednie nabłonka rogówki. Charakterystyczne są białe błony komórkowe otaczające ciemną cytoplazmę. Jądra komórkowe są najczęściej niewidoczne. 

Mikroskopia konfokalna, jako odmiana mikroskopii świetlnej, do tworzenia obrazów wykorzystuje widmo światła widzialnego. Jej unikalność polega na tym, że do obiektywu mikroskopu konfokalnego dociera tylko sygnał (światło) z jednej płaszczyzny ogniskowania, a nie z całego przekroju próbki (ryc. 1). Punktowe źródło światła (kondensor) oraz obiektyw mają ognisko w jednym punkcie preparatu (płaszczyzny konfokalne). Usunięcie promieni spoza płaszczyzny ostrego widzenia mikroskopowego (przez system specjalnych przesłon, z otworami „pinhole”) zapewnia zwiększony kontrast i rozdzielczość, w związku z tym lepszą jakość uzyskiwanych obrazów. Rozdzielczość osiowa rzędu 5–10 µm i rozdzielczość boczna 1–2 µm pozwala oglądać badaną tkankę w nawet 600-krotnym powiększeniu.

Biorąc pod uwagę fakt, że gałka oczna pacjenta podczas badania nigdy nie jest absolutnie nieruchoma (ruch wywołany tętnieniem krwi czy ruchami oddechowymi pacjenta), cyfrowe zdjęcia poszczególnych warstw tkanki muszą być wykonywane w bardzo krótkim czasie (czas ekspozycji nie może przekraczać 1/30 sekundy na klatkę), tak aby uzyskany obraz nie był poruszony i rozmazany.

Ryc. 3. Włókna nerwowe zrębu rogówki widoczne jako podłużne struktury o wysokiej reflektywności, keratocyty - jako owalne elementy o podobnej reflektywności. 

Obecnie używa się głównie dwóch typów mikroskopów konfokalnych: skanujące laserowe mikroskopy konfokalne (ang. Scanning Laser Confocal Microscopes) oraz mikroskopy konfokalne z wirującym dyskiem (ang. Spinning-disk Confocal Microscopes).

W zależności od zastosowanego źródła światła wyróżnia się mikroskopy konfokalne wykorzystujące wiązkę promieni laserowych lub wykorzystujące punktowe światło białe. Zastosowanie różnych technologii implikuje w tym przypadku różny zakres klinicznego użycia takich mikroskopów. Mikroskopia oparta na świetle białym dostarcza cennych informacji o strukturach komórkowych poszczególnych warstw rogówki i umożliwia optyczną pachymetrię, włącznie z automatycznym liczeniem liczby komórek (np. śródbłonka). Jej wykorzystanie możliwe jest jednak wyłącznie w centralnym obszarze rogówki. Słaba jakość zdjęć zrobionych poza centrum rogówki czyni je nieprzydatnymi w ocenie klinicznej.

Obszary mniej przejrzyste, takie jak rąbek rogówki oraz spojówka, mogą być natomiast oceniane w mikroskopach konfokalnych stosujących światło laserowe. Używając ich, nie wolno zapominać o niebezpieczeństwie uszkodzenia żywej tkanki przez światło lasera.

Ryc. 4. Endotelium widoczne w mikroskopii konfokalnej jako pojedyncza warstwa regularnie rozmieszczonych, heksagonalnych komórek, o jasnej cytoplazmie i ciemnych błonach komórkowych.

W jaki sposób przeprowadza się badanie?

Przygotowanie pacjenta do badania wymaga miejscowego znieczulenia worka spojówkowego i rogówki pacjenta w celu zmniejszenia odruchu mrugania i zapewnienia badanemu większego komfortu.

Pacjent w pozycji siedzącej siada przed mikroskopem i opierając brodę i czoło na podpórkach, podobnie jak przy standardowym badaniu w lampie szczelinowej.

Przed rozpoczęciem badania na soczewkę obiektywu mikroskopu należy nałożyć żel, działający jako środek immersyjny, poprawiający kontrast i rozdzielczość obrazu, a także chroniący powierzchnię oka przed bezpośrednim kontaktem z mikroskopem. Całe badanie trwa około 10 minut, w tym czasie uzyskujemy od kilkudziesięciu do kilkuset zdjęć z kolejnych warstw rogówki. Na analizę uzyskanych obrazów rogówki pacjenta badający musi przeznaczyć około 40 minut.

Przydatność mikroskopii konfokalnej w diagnostyce chorób rogówki

Badanie mikroskopem konfokalnym wymaga małego dystansu między badaną tkanką a obiektywem. Anatomiczna grubość rogówki i jej przejrzystość pozwalają obserwować wszystkie jej kolejne warstwy: nabłonek rogówki (ryc. 2) (komórki powierzchowne, komórki wielokątne, komórki podstawne), błonę Bowmana, istotę właściwą (ryc. 3) (część przednią, środkową i tylną; sploty włókien nerwowych), błonę Descemeta oraz śródbłonek rogówki (ryc. 4).

Przegląd literatury fachowej, dotyczącej badań z zastosowaniem mikroskopii konfokalnej, uzmysławia, w jak wielu problemach klinicznych ta stosunkowo nowa metoda obrazowa ułatwia diagnostykę, wyklucza lub potwierdza diagnozę kliniczną, a także wpływa na wybór strategii terapeutycznych. Spośród wielu patologii wymienić należy: choroby infekcyjne rogówki (charakterystyczny jest na przykład obraz infekcji pierwotniakiem Acanthamoeba (ryc. 5) lub niektórych infekcji grzybiczych i wirusowych), dystrofię Fuchsa, zmiany rogówki wywołane stosowaniem niektórych leków (na przykład amiodaronu czy chlorochiny), wpływ na rogówkę chorób metabolicznych, takich jak cukrzyca lub chorób spichrzeniowych, monitorowanie stanu rogówki po laserowych zabiegach refrakcyjnych, crosslinkingu, przeszczepach oraz po urazach, zmiany spowodowane noszeniem soczewek kontaktowych czy wreszcie zmiany wywołane starzeniem się organizmu. Pojedyncze badania w literaturze wskazują na przydatność mikroskopii konfokalnej w ocenie dynamicznych procesów zachodzących w filmie łzowym na powierzchni oka.

Ryc. 5. Skośny przekrój optyczny przez tylną część zrębu, błonę Descemeta i warstwę komórek śródbłonka rogówki. 

Pozarogówkowe i pozaokulistyczne zastosowanie mikroskopii konfokalnej

Mikroskop konfokalny stanowi dla lekarzy okulistów narzędzie do obrazowania nie tylko samej rogówki, ale także spojówki, rąbka rogówki i powieki.

Niezwykle cenna jest możliwość mikroskopowej oceny rąbka rogówki, szczególnie ze względu na popularne obecnie badania nad możliwością przeszczepów komórek macierzystych rąbka oraz znaczenie tego obszaru w procesie odrzutu przeszczepów rogówki i jego funkcji jako bariery spojówkowo-rogówkowej (przez którą do rogówki mogą wędrować komórki zapalne lub wrastać naczynia krwionośne).

Przy wykorzystaniu mikroskopu konfokalnego możliwe są różnicowanie i obserwacja procesów zapalnych lub zmian rozrostowych, guzów w obrębie spojówki, zarówno gałkowej, jak i powiekowej.

Charakterystyczna budowa skóry pokrywającej powieki (naskórek jest niezwykle cienki, budują go zaledwie trzy lub cztery warstwy komórek) i jej łatwa dostępność sprawiają, że patologie w obrębie powiek można badać mikroskopem konfokalnym. W przebiegu często spotykanego w praktyce klinicznej zapalenia brzegów powiek zastosowanie mikroskopii konfokalnej pomaga postawić diagnozę, określić ciężkość stanu klinicznego i zdecydować o ewentualnej konieczności zastosowania dodatkowego leczenia przeciwzapalnego.

Charakterystyka mikroskopii konfokalnej pozwala na wykorzystanie jej jako metody obrazowej nie tylko w obrębie oka, ale na całej powierzchni ciała człowieka dostępnej badaniu. Przyżyciowo za jej pomocą można badać skórę, błonę śluzową jamy ustnej i języka, a nawet zęby i dziąsła.

W skórze możliwe jest uwidocznienie komórek naskórka, a także gruczołów potowych lub zakończeń nerwów czuciowych. Badanie błony śluzowej jamy ustnej lub języka dostarcza (bezinwazyjnie) wielu cennych informacji w diagnostyce zmian przednowotworowych. W stomatologii poczyniono pierwsze próby praktycznego zastosowania mikroskopii konfokalnej w obrazowaniu na przykład, niemal niewidocznych gołym okiem, pęknięć szkliwa lub obszarów dekalcyfikacji zębów, a także przekrwienia dziąseł będących w stanie zapalnym.

Podsumowanie

Mikroskopia konfokalna jest przydatną klinicznie, nieinwazyjną metodą przyżyciowego obrazowania mikroskopowej struktury rogówki i spojówki oka, a także powiek. Mimo iż przeprowadzenie badania i jego analiza wymagają od badającego stosunkowo długiego czasu poświęcanego jednemu pacjentowi, zdarzają się sytuacje, w których właśnie zdjęcia z mikroskopu konfokalnego pomogą postawić właściwą diagnozę, monitorować w czasie przebieg choroby i wybrać właściwą strategię terapeutyczną. Trwający dynamiczny rozwój i doskonalenie techniki mikroskopii konfokalnej umożliwi lekarzom już w niedalekiej przyszłości uzyskiwanie trójwymiarowych obrazów prezentujących przestrzenne zależności między elementami strukturalnymi badanych tkanek.

„Przegląd Okulistyczny” 2009, nr 6 (32), s. 10-11.