Prof. dr hab. n. med. Edward WYLĘGAŁA¹

Dr n. med. Sławomir TEPER ²

Dr n. med. Jarosław PIŁAT ³

Oddział Okulistyczny Okręgowego Szpitala Kolejowego w Katowicach ^{1, 2, 3}

Oddział Okulistyczny Szpitala Śląskiego w Cieszynie ²

Podstawy genetyki AMD

Schorzenie, które określamy fenotypowo jako AMD, jest być może niejednorodną grupą chorób o odrębnej ścieżce patofizjologicznej i odrębnym genotypie.

Rozważanie na temat genetyki rozpocznijmy od stwierdzenia, że schorzenie, które określamy fenotypowo jako AMD, jest być może niejednorodną grupą chorób o odrębnej ścieżce patofizjologicznej i odrębnym genotypie. Powszechnie stosowane w diagnostyce kryteria AREDS biorą pod uwagę wyłącznie proste cechy fenotypowe. Klasyfikacja nie uwzględnia nowszych metod badania plamki, tj. OCT czy autofluorescencji, co wydaje się mieć istotne znaczenie. Jak dotąd nie wyodrębniono żadnej wyraźnie różniącej się grupy genotypowej – być może implementacja wspomnianych metod ułatwiłaby to zadanie. Na razie omówienie musi dotyczyć szeroko pojmowanego AMD w ujęciu fenotypowym.

Wstęp do genetyki – od A do Z (w uproszczeniu)

A. Cząsteczkami odpowiedzialnymi za regulację wszelkich procesów w organizmie są białka.

B. Informacja o budowie białek jest zakodowana w materiale genetycznym.

C. Materiał genetyczny jest w komórkach eukariotycznych (zawierających jądro komórkowe) zlokalizowany w jądrze komórkowym i zbudowany z dwuniciowego kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA).

D. DNA ma układ podwójnej helisy (dzięki wiązaniom wodorowym między zasadami obu nici), składa się z nukleotydów: adeniny, cytozyny, guaniny i tyminy. Sekwencja tych czterech nukleotydów stanowi kod genetyczny.

E. Wiązania wodorowe są specyficzne: adenina zawsze łączy się z tyminą, a guanina z cytozyną. Zapewnia to precyzję w kopiowaniu DNA.

F. DNA jest nawinięty na histony i wielokrotnie skręcony; tworzy poszczególne chromosomy.

G. Mamy 22 pary autosomów oraz jedną parę chromosomów płciowych: XX u kobiet oraz XY u mężczyzn. Na końcach chromosomów znajdują się sekwencje telomerowe, które skracają się podczas każdego podziału komórki (z pewnymi wyjątkami).

H. Wszystkie chromosomy jednej pary to łącznie genom. Natomiast cały materiał genetyczny danego człowieka (z wyjątkiem jednoniciowego DNA mitochondrialnego) warunkujący cechy dziedziczne to genotyp.

I. Podczas podziału komórki (mitozy) cały genom musi zostać skopiowany i przekazany komórkom potomnym – ze względu na podwójny zestaw chromosomów mówimy o komórkach diploidalnych.

J. W komórkach germinalnych (rozrodczych) dochodzi do mejozy: podziału, w wyniku którego powstają komórki haploidalne z jednym zestawem chromosomów.

K. W trakcie mejozy zachodzi wymiana materiału genetycznego (rekombinacja) między parami chromosomów homologicznych (tej samej pary) pochodzących od matki i ojca, tzw. crossing-over.

L. W obrębie DNA znajdują się jednostki funkcjonalne – geny. U ludzi jest ich ok. 20 tys.

M. Geny kodują poszczególne białka. Uwaga! Wbrew dawniejszemu paradygmatowi – jeden gen ≠ jedno białko (najczęściej).

N. Gdy gen ulega „przepisaniu” na białko, mówimy o jego ekspresji.

O. W obrębie genu znajdują się sekwencje kodujące (eksony) oraz niekodujące (introny), które ostatecznie nie zostają „przetłumaczone” na białko.

P. Synteza białka rozpoczyna się od przepisania kodu genetycznego DNA na hnRNA (transkrypcja) przez polimerazę RNA – jest to tzw. niedojrzały mRNA, który zawiera jeszcze kod pochodzący z intronów. Aby polimeraza zaczęła działać, musi „znaleźć” region promotorowy genu – podstawowe miejsce regulacji.

Q. Wycięcie z hnRNA nukleotydów z sekwencji niekodującej skutkuje powstaniem mRNA – matrycy, na bazie której powstanie białko.

R. mRNA ulega przepisaniu (translacji) na białko przy udziale rybosomów i cząsteczek tRNA, do których przyłączone są aminokwasy. Każdy aminokwas ma swoją cząsteczkę tRNA.

S. Kod genetyczny ma charakter trójkowy: kolejne trzy nukleotydy (kodon) oznaczają określony aminokwas białka, są odczytywane w tzw. ramce odczytu.

T. Białko może powstać ze złożenia nie wszystkich eksonów lub złożenia ich w różny sposób (tzw. alternatywny splicing) – mówimy wówczas o różnych izoformach tego samego białka np. VEGF₁₂₁, VEGF₁₆₅ (numer w indeksie dolnym oznacza liczbę aminokwasów).

U. Białka często ulegają ponadto dalszej obróbce potranslacyjnej – w ten sposób z jednego genu może powstać nawet kilka tysięcy różnych produktów (najczęściej kilka lub kilkanaście).

V. W obrębie genów występują polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) – dzięki nim różnimy się między sobą. To zmiany sekwencji w obrębie jednego nukleotydu. Są bardzo częste: występują średnio co 100 par zasad. Poszczególne SNP występują u więcej niż 5% osób w danej populacji. Te, które występują rzadziej, określamy arbitralnie mianem mutacji.

W. Poszczególne SNP można zblokować w haplotypy (odcinki 10–100 tys. par zasad) przenoszone wspólnie podczas mejozy – mechanizm crossing-over nie tasuje dokładnie genów pochodzących od matki i ojca. Gdy geny są blisko na chromosomie, będą z dużym prawdopodobieństwem przenoszone wspólnie bez rekombinacji – jest to nierównowaga sprzężeń.

X. Gdy na obu chromosomach mamy takie same allele (wersje danego genu w określonym miejscu – locus na chromosomach homologicznych) mówimy o homozygocie, jeżeli różne – o heterozygocie.

Y. Relacja między genotypem a fenotypem (zespołem wszystkich cech organizmu) jest złożona. Fenotyp powstaje z interakcji genotypu i środowiska. Często różne genotypy dają podobny fenotyp – w okulistyce szczególnie dobitnym tego przykładem jest retinitis pigmentosa związane z setkami różnych mutacji w wielu genach.

Z. Podstawowe sposoby dziedziczenia to:

a) autosomalnie recesywne (choroba, gdy 2 kopie genu),

b) autosomalnie dominujące (choroba, gdy 1 kopia genu),

c) sprzężone z płcią – z chromosomem X (mężczyźni chorują, kobiety przenoszą),

d) mitochondrialne (dziedziczone po matce) – losowy charakter mitochondriów danego oocytu sprawia, że choroba ujawnia się w różnym wieku i z różnym nasileniem,

e) wielogenowe – różne polimorfimzy i mutacje przyczyniają się do powstania choroby,

f) imprinting genomowy – dana cecha ujawnia się tylko, gdy dziedziczona jest od określonej płci (w przypadku pewnych genów i chorób od ojca, w innych – od matki), jest to zależne od metylacji, a tym samym wyciszenia niektórych genów, gdy pochodzą od określonej płci. Jest to jeden z mechanizmów zabezpieczających przed partenogenezą.

Badania bliźniąt

Pierwsze spostrzeżenia dotyczące rodzinnego występowania AMD pojawiły się w drugiej połowie XX w. dzięki badaniom rodzin chorych, a zwłaszcza badaniom bliźniąt monozygotycznych. Szybko stało się oczywiste, że dziedziczenie nie ma prostego mendlowskiego charakteru.

Badania bliźniąt są prowadzone nadal. Jednym z najważniejszych jest US Twin Study of Age-Related Macular Degeneration, które stało się możliwe dzięki istnieniu w Stanach Zjednoczonych rejestru bliźniąt – weteranów II wojny światowej. Baza danych obejmuje dane medyczne prawie 16 tys. mężczyzn urodzonych między1917 a 1927 r. Dziś, gdy podłoże genetyczne AMD jest uznanym faktem, 840 pacjentów (przy czym par bliźniąt jest 340) z badania jest doskonałym przykładem na uzupełnianie się czynników genetycznych i środowiskowych oraz epigenetycznych (związanych ze zmianą ekspresji/fenotypu, jednak bez zmiany sekwencji DNA – wykazano, że taki wpływ na określone geny mają np. niektóre składniki dymu tytoniowego).

Wyniki tego typu badań dowiodły, że 46–71% ryzyka zachorowania można przypisać czynnikom genetycznym, a 19–37% środowiskowym. Współczynniki odziedziczalności dla druz i zmian barwnikowych wynoszą od 0,26 do 0,71.

Dziedziczenie wielogenowe

Coraz częściej odkrywamy, że wiele chorób ma podłoże genetyczne. Nadciśnienie tętnicze, hipercholesterolemia, otyłość, cukrzyca i cały szereg innych zaburzeń metabolicznych ma związek z licznymi procesami komórkowymi o wielostopniowej, skomplikowanej regulacji. Jest ona uzależniona od dziesiątków genów cytokin, receptorów komórkowych, kinaz białkowych, czynników transkrypcyjnych itp. Każdy z nich zaś ma wiele wariantów. Dziedziczy się więc nie tyle sama choroba, ile raczej podatność na zachorowanie. Wpływ na rozwój schorzenia mają najczęściej także środowiskowe czynniki ryzyka, które w połączeniu z niekorzystną konstelacją wariantów genów doprowadzają do mniej lub bardziej istotnych zmian w funkcjonowaniu organizmu. Wieloetapowy przebieg chorób wiąże się także z istnieniem wariantów genów, które mogą opóźnić lub przyspieszyć progresję choroby. Ich potencjalny związek z procesem chorobowym może być odległy. Łatwo wyobrazić sobie sytuację, gdy pewien wariant genu zmniejsza odporność na zachorowania wirusowe, co w odległej perspektywie sprzyja kancerogenezie.

Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów

Jednym z najczęstszych zagadnień, którymi zajmuje się współczesna genetyka, są polimorfizmy pojedynczych nukleotydów. Popularny skrót, którym się je określa, to SNP (ang. single nucleotide polymorphism). Musimy sobie uświadomić, że bogactwo genetyczne gatunku przejawia się m.in. w występowaniu wielu wariantów genów, które są efektem nieustannie zachodzącego procesu mutagenezy. Zastąpienie pojedynczego nukleotydu w łańcuchu DNA może nastąpić w każdym miejscu naszego genomu. Gdy dokona się w komórkach germinalnych, zmiana taka zostanie przekazana potomstwu. Mutacja nie musi mieć jakichkolwiek konsekwencji dla białka, które powstanie jako produkt danego genu. Dzieje się tak z kilku przyczyn. Po pierwsze, w genie wyróżniamy sekwencje kodujące (eksony) i niekodujące (introny). Jeżeli mutacja zachodząca w intronie nie zmieni (przesunie) ramki odczytu lub nie doprowadzi do powstania kodonu „stop”, dla organizmu jest najczęściej bez żadnego znaczenia. Nawet gdy mutacja zajdzie w obrębie eksonów lub fragmentów regulatorowych genu, może również nie przełożyć się na zmianę jakościową czy ilościową danego białka. I wreszcie – nawet gdy białko ulegnie zmianie lub np. na skutek mutacji w regionie promotorowym genu powstanie większa liczba kopii białka, także może to nie mieć wyraźnych konsekwencji dla organizmu. Jednakże w pewnych sytuacjach okazuje się, że taki wariant sprzyja niektórym chorobom. Ewolucyjnie byłoby to niekorzystne i w dłuższej perspektywie można się spodziewać eliminacji takiego wariantu, chyba że pod innym względem staje się korzystny. Najczęściej podawanym przykładem jest w tym wypadku anemia sierpowatokrwinkowa. Choroba u homozygot jest niejako ewolucyjnie rekompensowana mniejszą podatnością heterozygot (a więc znacznie większego odsetka populacji) na malarię. Oczywiście, w wielu przypadkach nowo powstałe mutacje są letalne i nie przejawiają się fenotypowo bądź dają początek chorobie dziedziczonej autosomalnie dominująco lub nosicielstwu choroby recesywnej u potomstwa.

Różnica między mutacjami a polimorfizmami jest umowna i ilościowa. Mutacja jest wariantem danego genu i w populacji jest rzadka: występuje u mniej niż 5% osób. O polimorfizmie mówimy, gdy częstość występowania wariantu genu w populacji wynosi ponad 5%. Jeżeli dana mutacja powstała ewolucyjnie niedawno i jest korzystna w określonych warunkach środowiskowych, można oczekiwać, że stanie się z czasem polimorfizmem. Wbrew pozorom takie zmiany zachodzą niemal na naszych oczach – w Afryce zauważono pojawienie się odporności na zakażenie HIV, związane z modyfikacją receptora wykorzystywanego przez wirus do wniknięcia do limfocytów.

Nierównowaga sprzężeń i HapMap Project

Jeszcze do niedawna poszukiwanie polimorfizmów o istotnym wpływie na procesy chorobowe było działaniem po omacku. Mechanizm crossing-over zachodzący w trakcie mejotycznego podziału komórki prowadzi do „przetasowania” genów pochodzących od obojga rodziców. Mogłoby się wydawać, że jest to mechanizm całkowicie losowy. Tak jednak nie jest, w niektórych regionach chromosomu zjawisko to zachodzi częściej niż w innych. Geny sąsiadujące ze sobą na chromosomie unikną rozdzielenia z większym prawdopodobieństwem niż te w odległych od siebie loci. Zjawisko to, zwane nierównowagą sprzężeń, ułatwia przeszukiwanie całych regionów genomu pod kątem związku z procesami chorobowymi. Na skutek owej nierównowagi pewne allele obserwowane są w populacji z inną częstotliwością, niż można by oczekiwać. Oprócz prostej reguły bliskości loci istnieje też funkcjonalna nierównowaga sprzężeń. Gdy na skutek crossing-over dojdzie np. do powstania haplotypu letalnego, nie zostanie on zaobserwowany w populacji. I odwrotnie – jeżeli pewien haplotyp będzie wyjątkowo korzystny, możemy się spodziewać jego nadreprezentacji. Jednak podstawowy jest oczywiście pierwszy z wymienionych mechanizmów. Okazuje się, że miejsc, w których dochodzi do wymiany materiału genetycznego, jest podczas jednego podziału zaledwie kilkaset. Ułatwia to też badania przesiewowe członków rodzin chorych, ograniczając liczbę koniecznych markerów, ale znacząco utrudnia poszukiwanie konkretnego genu odpowiedzialnego za daną chorobę.

Przełomem stał się projekt mapy nierównowagi sprzężeń ludzkiego genomu – International HapMap Project. Drogę do jego rozpoczęcia otworzyły dwa artykuły: Rischa i wsp. oraz Landera i wsp. w „Science”, które ukazały się w 1996 r. Wykazano, że badanie związku często występujących wariantów genów z jednostkami chorobowymi wymaga badania szerokich grup populacyjnych. Wyliczono, że badania takie dostarczą więcej danych niż preferowane uprzednio badania powiązań prowadzone na rodzinach chorych. Jednocześnie zaproponowano utworzenie bazy danych wszystkich częstych wariantów genów. Ta idea przerodziła się w HapMap Project, który oparto na trzech populacjach: rasy kaukaskiej, czarnej i żółtej. Podstawowe założone etapy projektu zostały już zakończone, obecnie trwają badania nad szerszymi grupami populacji. W sumie odkryto ponad 4 mln polimorfizmów (ang. SNP) wraz z określeniem nierównowagi sprzężeń między nimi. Informacje te są w całości dostępne w bazie danych, którą można pobrać ze strony internetowej lub analizować z poziomu przeglądarki pod adresem http://www. hapmap. org. Projekt przyczynił się do odkrycia ogromnej liczby asocjacji między wariantami genów a chorobami, w tym AMD.

Metodyka badań genetycznych w AMD

Coraz częściej próbuje się ustalić zestaw najczęstszych markerów, które mogą z dużym prawdopodobieństwem wskazać osoby zagrożone rozwojem AMD. Kluczowe markery to niewątpliwie przede wszystkim polimorfizmy genetyczne. Poniżej przedstawiono przykładowy sposób ich oznaczania, opracowany w szczegółach przez firmę Genomed (Warszawa). Metoda wciąż pozostaje zbyt skomplikowana i kosztowna dla przeciętnego pacjenta. Dlatego wiele firm opracowuje i wprowadza na rynek zestawy do prostszego oznaczania Y402H CFH czy A69S ARMS2. Jednocześnie z każdym niemal miesiącem sekwencjonowanie genów staje się tańsze, a ponadto pozwala uzyskać szersze informacje m.in. na temat potencjalnych rzadziej występujących mutacji. Materiałem do badań genetycznych jest najczęściej krew obwodowa. Rozwój technologii izolacji DNA umożliwił znaczne uproszczenie: krew może być pobierana aseptycznie z palca ręki w ilości jednej kropli. W Okręgowym Szpitalu Kolejowym w Katowicach trafia ona bezpośrednio na karty FTA Micro Card firmy Whatman. Karty te zawierają opatentowane substancje chemiczne odpowiedzialne za lizę komórek i organelli komórkowych, denaturację białek oraz ochronę kwasów nukleinowych przed uszkodzeniem przez nukleazy, reaktywne formy tlenu oraz promieniowanie ultrafioletowe. Zabezpieczają też przed wzrostem bakterii lub innych mikroorganizmów. Znaczące ułatwienie dla badacza stanowią możliwość wieloletniego przechowywania próbek w temperaturze pokojowej oraz uniwersalność. Uwalniane kwasy nukleinowe są stabilizowane we włóknach macierzy karty. Na karcie mieści się 125 μl krwi lub 50 μl homogenatu tkankowego. Możliwość wykorzystania do dalszej analizy wymaga odczekania 30 minut. Wyekstrahowanie kwasu nukleinowego z karty odbywa się przez wymycie reagentem FTA Purification Reagent oraz buforem TE^-1 (10 mM Tris-HCI,0.1 mM EDTA, pH 8). Amplifikację materiału genetycznego wykonuje się za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Startery do reakcji PCR CFH można wybrać zgodnie z dostępnym piśmiennictwem. W naszym wypadku PCR objęła sekwencję kodującą eksonu 9 genu, z wykorzystaniem primerów 5’-TTTGAG- CAAATTTATGTTTCTCATTT-3’ oraz 5’-ACGGATGCATCTG-GGAGTAG-3’. Następnie wykonano sekwencjonowanie produktu amplifikacji przy użyciu sekwenatora kapilarnego. W oznaczeniu genu ARMS2 wykorzystano primery 5’­-GTGGAGAAGGAGCCAGTGAC-3’ i 5’­-CAGTGTCAGGTGGTGCTGAG-3’. Również w tym wypadku ostateczną analizą jest sekwencjonowanie DNA.

Oczywiście, sposób oznaczenia DNA jest indywidualną kwestią pracowni genetycznej. Nadal częściej wykorzystywanymi metodami są trawienie enzymami restrykcyjnymi i analiza elektroforetyczna fragmentów nici DNA na żelu agarozowym. Inne metody są mniej popularne.

Piśmiennictwo

Baird P.N., Islam F.M., Richardson A.J., Cain M., Hunt N., Guymer R. Analysis of the Y402H variant of the complement factor H gene in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006 Oct; 47 (10): 4194–4198.

Lander E.S. The new genomics: Global views of biology. Science 1996, 274: 536–539.

Risch N., Merikangas K. The future of genetic studies of complex human diseases. Science 1996, 273: 1516–1517.

The International HapMap Consortium. A haplotype map of the human genome. Nature 2005, 437 (7063): 1299–320.

Powyższy tekst stanowi fragment książki Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem. Bedeker Okulistyczny, która ukaże się nakładem Wydawnictwa Górnicki wiosną 2011 r.

„Przegląd Okulistyczny” 2010, nr 6 (38), s. 1-2.